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神经退行性疾病病理特征不对称程度的评估
生物样本库BS小组
摘要：
脑库使研究者可以获得具有完善特征的神经退行性疾病病例的组织。用于诊断的固定后的组织一般不适用于科研，而冰冻组织适合用于科研。许多脑库采用将一半脑组织固定而另一半脑组织冷冻的方案进行存储。近期一项研究表明两个半球的蛋白质——特别是tau和TDP-43的沉积不均匀。为检验该假设，本研究前瞻性地从入库时的30个大脑的双侧皮质块取样，使用免疫染色评估不对称程度。在14例阿尔茨海默氏症（AD）（修订版Braak病理分期V-VI期）中有6例存在tau蛋白的不均匀染色。有2例在距状皮质中的tau染色存在中度差异。然而仔细分析这些病例发现即使在同侧大脑相邻区域也存在tau染色差异。AD患者中仅有1例显示a-突触核蛋白染色不均匀，3例显示Ab染色轻度不均匀。2例额颞叶退化伴运动神经元病变病例中TDP-43病理呈均匀分布，但伴有AD时可见不均匀分布。总之，在神经退行性疾病中存在病理改变不对称的可能性，对神经退行性疾病样本实施一半冻存和一半固定时应当对此留意。尽管如此，临近皮层区域也可发现显著的染色差异，因此无法保证替代方案更优于现有方案。
关键词：脑库；不对称；神经退行性疾病；
前言
脑库是进行神经退行性疾病研究的重要资源。脑库允许研究者获得来源于特征明确的神经退行性疾病病例的组织。对神经病理学家来说，需要固定的组织进行充分和准确的诊断，而这种固定后的组织对需要用组织进行DNA/RNA或者生化分析的研究者而言用途有限。因此，许多地方接收新鲜脑组织样本的时候采用如下方案：通常将一半脑组织冰冻而另一半用福尔马林固定进行神经病理检查。实际中采用的方案可能会有所不同，有的地方总是固定同一个半球的组织，而有些则视个体情况而定。最近文献表明(Stefanitsetal.)，这个总体方案可能存在某些问题，因为某些神经退行性疾病的病理分布可能是不对称的。作者指出对阿尔茨海默病（AD）的病例进行评估发现tau和TDP-43在部分病例中分布不均匀。不过，该比较主要针对海马体和内嗅皮层。我们旨在前瞻性地在更广范围的皮质块和更宽范围的病种中比较一组蛋白质在双侧脑组织中的染色，以测试这种不对称的观点。
材料和方法
选择新到达MRC（医学研究委员会）伦敦神经退行性疾病脑库的病例30例。表1显示所有病例。如表所示，这些病例大多有2-3种病程。根据修订版的Braak/BNE分期，将阿兹海默病进行病理分级，并与Thal分级关联，并根据最新美国国立衰老研究院和阿尔茨海默病协会(NIA-AA)指南进行注释。具有路易体痴呆症（DLB）病理的病例根据DLB联合会标准进行分级，伴有额颞叶退化的运动神经元病按常规标准进行分级，TDP-43病理染色与AD关联分级。在罕见诊断中有两例AD有后皮质萎缩病变（PCA），一例有银颗粒病（AGD），一例有皮克病（PID），一例有球状胶质tau蛋白病（GGT）。两例对照最高为修订版Braak/BNE分期I-II期的病例。在新鲜脑组织到达实验室时，在对新鲜半球进行切片之前从两个半球中都取出以下额外的组织块：额中回、颞中回、前扣带回、侧顶叶和距状裂皮层(表2)。经挑选用最少的组织块并避免对用于研究重要的的小块区域（例如海马）造成损伤，主要用于对AD、DLB和FTLD-TDP/MND的中-高度分级进行检测。所有组织块在福尔马林缓冲液中固定48小时并进行石蜡包埋。虽然不同病例中固定程度（和染色强度）存在可能的差异，但同一病例由于处理的一致性基本不存在此问题。所有的块都切成7微米厚度的切片并用苏木精-伊红染色（HE）。相邻的切片同时用鼠抗磷酸化tau[克隆AT-8，1:，AUTOGENBioclear（英国）有限公司，威尔特郡，英国]、α-突触核蛋白（42/α-突触核蛋白，1:，NovocastraLaboratories有限公司，泰恩河畔纽卡斯尔，英国）和淀粉体β（Aβ）（1:，Chemicon公司，加州特曼库拉，美国）单克隆抗体进行免疫组化染色，或者使用针对磷酸化（p）TDP-43的兔多克隆抗体（pS/-2;1：1，CosmoBio有限公司，日本东京）并使用徕卡BONDMAXTM系统（LeicaBiosystems公司，威兹拉，德国）处理。对pTDP-43（ER1处理30分钟）和tau（ER1处理20分钟）用LeicaBONDMAXTM抗原修复系统进行处理。对于α-突触核蛋白和αβ，用80%甲酸进行预处理（1小时）。细胞核通过Harris明矾苏木精进行复染。
检测用的切片在不知道最终诊断的情况下进行盲判。对皮层每个区域（含双侧来源）的蛋白质染色密度进行半定量分析（根据空白、浅/罕见、中度、重度/广泛划分）。三位神经病理专家（AK、IB、SAS）均独立评判最终的诊断并且（盲判）对每例进行双侧评分。诊断和评分由AK进行审查，如有分歧则与相应的神经病理专家单独讨论至与AK最初的诊断达成部分共识，评分同时由IB/SAS进行审查以消除偏倚。使用一半脑组织和大量组织块得到的最终诊断列在表2中。
结果
结果列于表3。在6个BNE/Braak分期V期和VI期的AD病例中，存在一些tau的不对称染色（43%）。此类不对称程度有轻度和中度（图1a，b）。3个病例中距状皮层中tau染色有轻度差异，因此从两侧脑组织染色得出的的修订版Braak/BNE分期可能不同。其中一个病例中（病例5）可能导致BNE/Braak分期从V期升至VI期。在两个病例中（病例2和6）可能导致分期从VI期降至V期。理论上，在病例2和6中如果只对距状皮层进行判断可能会有人认为分期可降至IV期(Alafuzoffetal.)，但这基本不可能，因为在两个病例中两侧其他皮层区域均存在一致的tau蛋白高密度染色。一个病例（病例14）显示前额叶tau染色中度差异但对于分期没有影响。两个病例中（病例1和9）距状皮层区两侧tau染色具有中度差异。两个病例中该结果可导致BNE/Braak分期从V期升至VI期。在该两例中其他区域只显示出tau染色的轻度不对称。同样的对病例1和9检查同一半球（病例1左半球，病例9右半球）更大的诊断组织块时，分别发现在枕叶区同一组织块中有显著的tau染色差异（图1c,d），因此说明至少在该区域一定程度上存在蛋白质的不均一分布。此外，病例1和9中诊断组织块的Thal分期分别为4和5（也在具有低tau蛋白密度的同侧），因此根据NIA-AA共识标准，这种情况看来应该否定tau蛋白不对称的意义。PCAAD的两个病例中并未显示距状皮层tau染色的不对称性。罕见tau病变（PiD，GGT）结果均表明病灶tau染色的轻度不对称。AD的三个病例（BNE分期III-VI）脑实质染色中Ab染色仅显示轻度不对称（Fig.1e,f）。α-突触核蛋白显示出高度对称的染色，除了一个病例（病例11）在右侧顶叶显示出非常轻微的路易体病变，而其左侧没有。在2例FTLD-MND患者中pTDP-43病变表现为对称型，但在除AD病变以外存在pTDP-43染色不对称（Fig.1g,h）。事实上6例额外有pTDP-43的AD患者中有3例皮质中存在pTDP-43，并且这3例均有一定程度的不同染色（2例中度，1例轻度）。
讨论
脑库是允许研究者获得来源于神经病理特征明确的神经退行性疾病病例组织的重要资源。由于这些研究者经常需要冰冻组织，他们通常无法把用于神经病理诊断的同样组织用于研究。因此，必须假定所使用的冰冻组织与诊断用的组织具有非常相似的病理组成。虽然理论上脑库一接收到新鲜大脑组织就立刻可以对相邻区域进行解剖，以使一部分冷冻用于科研而其他用于固定和诊断，但由于两个主要原因，在这个体系中仍存在一些局限。（1）由于经济/人力原因，在大部分脑库特别是在英国（也许还有其他地方）这样做不现实。（2）许多病例中大脑的总体直观特征（甚至只有一半大脑）在经过充分的固定后可以更好地进行观察，否则一些细节特征可能被忽视，而且从新鲜大脑取组织块时会使一些较小的区域（例如海马）等收到扭曲等人为因素的影响。基于上述原因以及可能由于历史原因，在很多脑库中出台的方案通常是一半大脑组织冷冻用于研究（可能冷冻前或冻透前先切开）且另一半留在福尔马林里用于后续显微镜检查、组织块选择和神经病理诊断。对于该方法的一些批评意见可追溯至二十世纪八十年代。近期发表的文章指出这一整套方案确实可能存在问题，因为在一些神经退行性疾病的病理分布可能不对称。作者指出对阿兹海默病病例（单纯病理特征或附带路易体病理或者CVD）的分析中观察到了tau和TDP-43染色的不对称。不过该研究主要针对海马和内嗅皮层进行分析。我们的研究目的更具前瞻性并且涉及更宽范围的皮质块以及更广泛的疾病范围。但我们的方法也存在一定局限，不包括海马区的原因在于有人认为这种从新鲜组织处理和取样方式可能导致样品破裂/变形，从而可能影响最终的诊断。不过反之，这使得我们不允许做出更低级别的修订版Braak/BNE分期的评判，但是可以允许做出精确的更高级别分期的评判。本研究表明在一些AD病例中存在部分tau染色不对称，并可能在理论上导致在不同侧大脑Braak/BNE分期评判的差异。然而，对诊断组织块的仔细检查揭示了甚至在同侧tau染色也存在显著的差异。多年以前曾在神经元纤维病理中有类似发现。值得欣慰的是这些在距状皮层区表现为tau染色不对称的病例在其他组织块中tau染色相对均匀。由于这些病例的诊断组织块中Ab病理的Thal分期为4或5，他们非常有可能达到新共识NIA分级的中级或高级AD神经病理分期。这之中任一水平均足以将AD诊断为痴呆的病因。另外，如果在分期中tau病理的不对称表现为一个突出的问题时，可以在PCAAD的病例中观察到这种现象，其中tau病理“跳过”了在典型的染色处理中的皮层区域，却主要在枕叶中出现。PCAAD病例中距状皮层没有tau染色的不对称现象。Ab的结果表明在AD病例中实质有轻微的染色不均匀。DLB病例中α-突触核蛋白染色的相对均匀和Setfanits等的结果一致，并且并非完全出人意料，特别是当使用“阳性或阴性“两级标准（有或无）而不是用染色的相对密度进行衡量。两例FTLD-MND病例显示pTDP-43均匀染色，但是病理却确认为B亚型，这是一种与A或C亚型相反并被认为可能有不对称萎缩及不均匀染色的亚型。本研究中最有趣的是观察到pTDP-43的不均匀染色与AD有关联。同时最初以为额外的pTDP-43病理是意外的发现，现在已经有人认为有某些重要的临床相关性。尽管此处并未得到证明CVD可能存在问题，因为多发性梗阻型痴呆就其本质而言为多发病灶，因此可能证明为不对称性的。此处的病例则可以作为好的证据，因为至少从两侧半球中都取了一些组织进行冰冻和诊断。总之，我们的结果与Stefanits的结果类似，确实表明在AD的一些病例中tau染色不均匀，这种不均匀通常比较轻微，并且只将BNE/Braak分期从V期升至VI其，反之亦然。我们有两例病例证明，这种样品的问题甚至还可能在同一侧大脑半球中出现。因此从同一新鲜大脑半球相邻的皮层区域采集冰冻和诊断组织作为备选的策略，在理论上更好但是可能更费时间的方法，并不一定能够解决上述这种问题。因此，如果脑库工作人员仍延续目前冰冻一半大脑组织并且固定另一半的方法，建议要保持谨慎。确实，对于病例中存在明显的肉眼可见不对称病例如CVD和/或可疑的FTLD时，明智的做法是至少对两侧大脑半球的一些小的区域都进行冷冻和固定。在AD某些病例中pTDP-43染色的显著不均匀性的重要性尚不明确，还需要更多相关的临床病理研究。
编者按：本文旨在通过前瞻性地分析大脑两半球免疫病理变化的不对称程度，以期对目前常规的将脑组织样本一半固定另一半冷冻的保存方案进行探讨。通过对30个大脑组织的免疫组化染色发现确实存在某些成分分布不均匀的现象，而且情况各异，但是对于大多数病例，这种情况对于最终的病理诊断影响不大。因此考虑到这种情况，在人力物力允许的情况下，可以考虑在常用方案基础上，对于一些病例分别对两侧大脑进行更为细致的采样，以获得更为客观的结果。这种为了实现病理诊断和用于科研的样本尽量精确吻合的思路，也值得对其他类型组织进行分析时考虑借鉴。
注：文中表格及图片信息请参考原文链接。
作者：AndrewKing,etal.
翻译：周坤，吉栩
校审：郭乔楠
原文：
Assessmentofthedegreeofasymmetryofpathologicalfeaturesinneurodegenerativediseases.Whatisthesignificanceforbrainbanks?JNeuralTransm(Vienna).Oct;(10):-.doi:10./s--1-8.EpubMay29.
